【ns3fb】浅谈基于片段的药物设计

引言

《Nature Reviews Drug Discovery》杂志发表了摘要《Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery》，详细说明了2016年FBDD方法的发展和未来前景。

无独有偶，JMC杂志2017首刊第一篇文章《Journal of Medicinal Chemistry, Technological Advances: Highlights 2015–2016》对过去1年发表在该杂志上的技术亮点点评中就专门提到FBDD技术的最新发展。FBDD作为鉴定新型苗头化合物的关键技术，逐渐成为药物研发中的主流方法。

“基于结构的药物设计（Structure-based drug design, SBDD）”、“基于片段的药物设计（Fragment-based drug design, FBDD）”和“基于配体的药物设计（Ligand-based drug design, LBDD）”等几个专业术语从来都是药化学家们口中离不开的话题。小编在最近的几次客户拜访后，惊奇地发现大家一时间似乎都对FBDD很感兴趣，于是乎产生了扒一扒FBDD的“冲动”。

我们所熟悉的传统药物研发，主要通过从天然活性产物中发掘或从已有化合物数据中随机筛选来发现新药。这种方法效率低，盲目性大。药物化学家们为了提高新药研发的效率，一直致力于寻找新的药物设计和药物筛选方法，于是乎就有了高通量药物筛选（high-throughput screening, HTS）和组合化学等方法。截止到21世纪初，很多公司已经构建了数百万的化合物库，通过HTS方法从中筛选出不少候选药物，特别是针对已确证的靶标。然后，面对全新的靶标和一些复杂的靶标，HTS却不尽如人意，要么筛不到理想的化合物，要么命中的化合物具有很高的假阳性，或者类药性差。如此，还需要更多的方法来弥补和完善。

FBDD方法的发展

一个药物分子结构，组成它的每一个片段都发挥着自身的作用，所以研究者就设想将不同的结构片段进行组合或者延伸，以期得到新的药物分子。这从理论上讲，是可行的。根据这种设想，Jencks等人[1]于1981年搭建了FBDD的理论框架，由此，FBDD方法开始应用于药物设计领域。与筛选数百万级别的化合物数据库直接寻找药物尺寸（drug-size）（药物尺寸，即成药分子相当大小的分子）的分子不同的是，FBDD方法是以筛选小片段结构为起点，结构片段通常包含不到20个重原子。Hann等人[2]2001年首次提出“molecular complexity”概念，认为分子变得越复杂（分子结构变大，特征变多），与蛋白之间则可能有更多的相互作用，而相互作用可以是任何的蛋白接触，比如氢键相互作用、疏水相互作用。可以是有利的相互作用，也可能是不利的相互作用。对于一个可能成为潜在药物的分子，增加有利的相互作用才是关键。小片段自身虽然只有较少的蛋白相互作用（弱结合），但其优势在于可以结合一个蛋白的多个位点或者多个蛋白，如此以片段为起点筛选可以提高命中率。命中的片段如果能通过一定方法连接或组合成一个复杂度相当的大分子，即达到药物尺寸，则很可能成为靶标的潜在药物，发挥与靶标之间尽可能多的相互作用。

相对大分子的筛选，片段筛选则有其实际性的优势：首先，收集、维护和筛选几千个片段库要比数百万的大分子数据库更加容易，这使得企业和学术机构都能去做先导物的发现工作；其次，更高的筛选命中率可以实现对复杂靶标尤其涉及到蛋白-蛋白相互作用靶点的处理；除此之外，片段的尺寸小，溶解度高，通常具有更好的药物属性，后期易于结构优化，更有潜力成为药物分子。

1996年，Fesik等人[3]在制药公司

Abbott报道了采用核磁共振构效关系研究法（SAR by NMR）识别结合在靶蛋白活性口袋的低分子质量的片段，将这些片段优化或连接就能快速发现高活性的先导化合物。近20年的发展，使得FBDD方法逐渐成为HTS的重要替代手段之一。FBDD的理论认为，许多药物靶点的活性口袋是由多个亚活性腔组成的，HTS得到的活性化合物的各个片段往往不能与靶蛋白的亚活性腔很好地结合，而且对其中的单个片段的优化往往会影响整个分子，甚至会导致与靶点结合位置的改变，从而导致活性丧失。而FBDD方法是将与靶蛋白各个亚活性腔特异性结合的片段以合适的连接子连接起来（如图1），组装成具有高活性的化合物，因此通过FBDD方法设计的药物往往具有高活性和高选择性的特点。

图1 HTS的劣势和FBDD的优势。

FBDD方法的第一步就是建立合理的片段库，片段库的建立可以参照HTS化合物库建立的一些原则。当然，FBDD的片段库也有自身的特点：片段分子量小，氢键供体和受体数目少，与靶点的结合力弱，此外，片段还要有很好的溶解性以便于在高浓度溶液中检测片段活性。很多片段库中的片段分子则满足“三规则”，分子量小于300，氢键供体和受体不超过3，可旋转键数目不超过3，cLogP小于3。片段库建立之后，最关键的步骤就是筛选和识别与靶蛋白弱结合的活性片段。目前识别片段主要有5大技术：生物化学检测、表面等离子共振技术（SPR）、核磁共振技术（NMR）、质谱（MS）和X射线单晶衍射（X-ray）技术。识别活性片段后，就要对片段进行优化和连接。最主要的三大策略是片段连接（fragment-linking）、片段合并（fragment-merging）和片段生长（fragment-growing）。

FBDD技术的成功应用

随着计算机技术的发展，CADD围绕这三大策略，在hit-to-lead方面分别产生了不少成功的应用。目前，已有30多个候选药物进入临床，包括2个已经成功上市[4]（表1）。

表1 基于FBDD方法成功进入临床测试包括已被FDA批准的药物（选取部分）[4]。

FBDD方法大大加快了苗头化合物的识别和发现，最有名的例子即成功上市的vemurafenib发现和设计。Vemurafenib是第一个成功的经FBDD方法开发并被批准上市的BRAF-V600E激酶抑制剂[5]，用于治疗黑色素瘤。最初通过片段库的筛选发现的片段（如图2上）是针对另外一个激酶，serine/threonine-蛋白激酶PIM1。通过一系列的优化，最终得到vemurafenib分子（如图3）。从结构上看，Vemurafenib在BRAF-V600E活性口袋中结合非常稳定，形成的4个氢键相互作用很好地固定了Vemurafenib在口袋中的结合（图4）。这个成功的案例从最初的片段筛选到vemurafenib被FDA批准上市仅仅花了6年时间。

图2 抑制剂Vemurafenib的发现[5]。

图3 Vemurafenib的研发流程，PLX4720是Vemurafenib的同系物[5]。

图4 Vemurafenib在BRAF-V600E活性口袋中的结合，虚线表示与关键残基间的氢键相互作用[5]。

接下来，要说一说FBDD方法另一个优势：对于复杂靶标，HTS方法往往找不到理想的苗头化合物。比如，涉及蛋白-蛋白相互作用的靶点，其结合口袋通常是平坦的，化合物很难结合上去，而这个时候，FBDD方法则可以先识别弱结合的化合物片段，以及能同时结合多个蛋白多个位点的片段。这是X-ray等方法很难做到的，通过NMR方法则可以进行片段筛选，进一步指导片段优化，形成潜在药物分子。成功的案例如BCL-2选择性抑制剂venetoclax（如图5），2016年4月被FDA批准用于治疗顽固性慢性淋巴细胞白血病[6]。最初的设计是通过片段筛选，找到能同时结合BCL-XL两个不同区域的片段，再通过片段连接，设计出BCL-2和BCL-XL的双靶标抑制剂，后期不断优化结构，得到BCL-2选择性更高的venetoclax（图5d）。

图5 基于片段a和b设计的BCL-2选择性抑制剂ABT-199及其在BCL-2活性口袋中的结合模式[6]。

除此之外，FBDD方法还推动了化学生物学的发展，寻找更多的方法来修饰蛋白质行为和探索生物学效应。其中，典型的案例是通过FBDD方法寻找KRAS潜在位点，KRAS是一个小的GTP酶，很早之前就被认为是很多癌症发生的主要驱动子。已经有很多团队通过FBDD方法识别出KRAS的多个位点，以及能结合在这些位点的片段分子。基于这些筛选的小分子，已经成功优化出不少细胞-激活的先导化合物（如图6）[7]。另外一个例子是通过FBDD方法，成功识别酶的催化剂，提高和改变单个酶的活性。首先通过FBDD方法找到能结合在Hepatitis C virus的蛋白酶的两个功能区域的片段分子，再基于片段优化得到能结合在该结合口袋的强效抑制剂（如图7）[8]。这个案例进一步说明了FBDD方法是化学生物学上寻找新的小分子结合口袋的强有力工具，一旦结合口袋确定，片段筛选就可以筛出潜在结合的化合物分子。

图6 基于FBDD方法分别识别的RAS三个位点及优化的分子[7]。

图7 基于FBDD方法发现的Hepatitis C virus NS3的新型结合位点[8]。

FBDD未来展望

FBDD在片段库的设计、检测手段、先导化合物的发现策略方面与传统的药物设计有明显的不同，具有更加突出的优势：片段库涵盖的化学空间更广筛选的分子数量更少，发现活性化合物的概率更大，合成的化合物活性更高。而且随着技术的不断进步，检测片段与靶蛋白之间的弱结合作用变得越来越容易，推动了FBDD的飞速发展。FBDD还与CADD技术相结合，运用分子模拟的手段指导药物设计，获得了极大的成功，各种基于片段的药物设计软件也相继开发上市，如Chemical Computing Group开发的Molecular Operating Environment (MOE)。虽然FBDD方法已逐渐成为药物研发的主流，但其未来20年的发展仍将面临不小的挑战：首先，片段库的质量是关键，需要保证片段具有良好的理化性质且片段尽可能小，满足较大的化学空间需求；其次，FBDD方法需要改善和提高的地方是开发更多方法、技术来监控和识别片段与靶蛋白的结合，只有更为方便和准确地识别发生弱作用的片段，才能更好地基于片段进行药物设计；最后一点也最重要的是如何将片段优化到先导化合物，在充分利用片段连接、片段合并和片段生长等技术的前提下还要不断开发新的方法来提高优化设计的效率和成功率。

参考文献：

1.Jencks, W. P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78(7), 4046-4050 (1981).

2.Hann, M. M. et al. J. Chem. Info. Comp. Sci. 41(3), 856-864 (2001).

3.Shuker, S. B. et

al.

Science 274(5292), 1531 (1996).

4.Erlanson, D. A. et al. Nat. Rev. Drug di(9), 605-619 (2016).

5.Bollag, G. et al. Nat. Rev. Drug discov. 11(11), 873-886 (2012).

6.Souers, A. J. et al. Nat. Med. 19(2), 202-208 (2013).

7.Winter, J. J. et al. J. Med. C(5), 2265-2274 (2015).

8.Saalau-Bethell, S. M. et al. Nat. Chem. Boil. 8(11), 920-925 (2012).